Методика измерений массовой доли соевого ингибитора трипсина: особенности разработки и аттестации

   Современная индустриализация повышает требования к точности определения аллергенов, особенно в отношении оказывающих негативное воздействие, среди них – соевый ингибитор трипсина (СИТ). Корректное определение наличия СИТ в пищевых продуктах, содержащих соевые бобы, является ключевым для контроля безопасности и маркировки продукции. Сложилась общепринятая практика определять аллергены сои количественно с помощью аналитических методов анализа. Авторы данной статьи поставили цель разработать и аттестовать методику измерений массовой доли СИТ методом иммуноферментного анализа – методику, способную повысить специфичность метода и избежать ложноотрицательных результатов ее применения.

   Объектом исследования стал метод анализа пищевых аллергенов – иммуноферментный анализ, реализованный набором реагентов производства ООО «ХЕМА».

   В процессе разработки методики измерений оптимизированы основные методические факторы, влияющие на точность результатов измерений: масса пробы, время ее экстракции, время и скорость центрифугирования пробы, соотношение надосадочной жидкости и ИФА-буфера, температура инкубации, время взаимодействия комплекса антитело-аллерген с окрашивающим агентом, длина волны для измерения оптической плотности и максимальное время для измерения оптической плотности после введения стоп-реагента. Разработанная методика апробирована в ходе межлабораторного эксперимента с участием 5 лабораторий. Метрологические характеристики установлены в соответствии с РМГ 61–2010. Предлагаемый метод был аттестован в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-2009, № 102–ФЗ. Метод имеет широкий диапазон количественного определения массовой доли СИТ от 0,5 до 25,0 мкг/кг (ppb) с пределом обнаружения 0,1 мкг/кг (ppb) и относительной погрешностью 40 %. По результатам проведенного исследования в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений (ФИФ) зарегистрирована аттестованная методика идентификации и количественного определения содержания неинфекционных пищевых аллергенов белкового растительного происхождения в пробах всех видов пищевых продуктов и объектов, связанных с требованиями к пищевой продукции, смывов, отбираемых с рабочих поверхностей при проведении производственного контроля, с помощью наборов реагентов для иммуноферментного анализа производства ООО «ХЕМА» № ФР.1.31.2022.43884. Методика предназначена для применения в испытательных лабораториях, занимающихся контролем качества и безопасности выпускаемой продукции, может быть использована для подтверждения соответствия продукции обязательным требованиям, установленным в Техническом регламенте Таможенного союза ТР ТС 022/2012.

1. Jiang X., Jackson L. S. Food allergens // Encyclopedia of Food Safety (Second edition). Academic Press, 2024. P. 295–308. doi: 10.1016/B978-0-12-822521-9.00233–1

2. Намазова-Баранова Л. С. Аллергия у детей: от теории к практике. М.: Союз педиатров России. 2010–2011. 668 с.

3. EAACI food allergy and anaphylaxis guidelines: diagnosis and management of food allergy / A. Muraro [et al.] // Allergy. 2014. Vol. 69, № 8. P. 1008–1025. doi: 10.1111/all.12429

4. Пищевая аллергия / А. А. Баранов [и др.]. М.: Педиатръ, 2013. Сер. Болезни детского возраста от А до Я.

5. Prescott S., Allen K. J. Food allergy: riding the second wave of allergy epidemic // Pediatric Allergy and Immunology. 2011. Vol. 22, № 1. P. 156–160. doi: 10.1111/j.1399–3038.2011.01145.x

6. Codex Alimentarius: International food standarts. Code of practice on food allergen management for food business operators CXC80–2020 Adopted in 2020.

7. Kerezsi A. D., Jacquet N., Blecker Ch. Advances on physical treatments for soy allergens reduction – A review // Trends in Food Science & Technology. 2022. Vol. 122. P. 24–39. doi: 10.1016/j.tifs.2022.02.007

8. L’Hocine L., Boye Jo. I. Allergenicity of soybean: new developments in identification of allergenic proteins, cross-reactivities and hypoallergenization technologies // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2007. Vol. 47, № 2. P. 127–43. doi: 10.1080/10408390600626487

9. Пищевая аллергия: Клинические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации. М.: Союз педиатров России, 2018. 50 с.

10. Vagadia B. H., Vanga S. K., Raghavan V. Inactivation methods of soybean trypsin inhibitor – a review // Trends in Food Science & Technology. 2017. Vol. 64. P. 115–125. doi: 10.1016/j.tifs.2017.02.003

11. Stability of the allergenic soybean Kunitz trypsin inhibitor / R. Roychaudhuri [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 2004. Vol. 1699, Iss. 1–2. P. 207–212. doi: 10.1016/j.bbapap.2004.02.014

12. Comparison of physicochemical properties of recombinant buckwheat trypsin inhibitor (rBTI) and soybean trypsin inhibitor (SBTI) / Ch. Li [et al.] // Protein Expression and Purification. 2020. Vol. 171. P. 105614. doi: 10.1016/j.pep.2020.105614

13. Recent advances and challenges in food-borne allergen detection / A. Sena-Torralba [et al.] // TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2020. Vol. 132. P. 116050. doi: 10.1016/j.trac.2020.116050

14. Sensitive detection of soy (glycine max) by real-time polymerase chain reaction targeting the mitochondrial atpA Gene / T. Bauer [et al.] // AOAC International. 2011. Vol. 94, Iss. 6. P. 1863–1873. doi: 10.5740/jaoacint.10–257

15. Development of a real-time PCR method for the simultaneous detection of soya and lupin mitochondrial DNA as markers for the presence of allergens in processed food / A. M. Gomez [et al.] // Food Chemistry. 2011. Vol. 127, Iss. 2. P. 834–841. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.01.019

16. Advanced DNA- and protein-based methods for the detection and investigation of food allergens / M. Prado [et al.] // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2016. Vol. 56, № 15. P. 2511–2542. doi: 10.1080/10408398.2013.873767

17. Development and validation of a specific sandwich ELISA for determination of soybean allergens and its application in processed foods / L. Zhu [et al.] // Process Biochemistry. 2022. Vol. 117. P. 134–141. doi: 10.1016/j.procbio.2022.03.022

18. Determination of egg and milk allergen in food products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on signature peptides and isotope-labeled internal standard / S. Fan [et al.] // Food Science and Human Wellness. 2023. Vol. 12, Iss. 3. P. 728–736. doi: 10.1016/j.fshw.2022.09.006

19. Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels : A review / X. Pei [et al.] // Analytica Chimica Acta. 2013. Vol. 758, Iss. 3. P. 1–18. doi: 10.1016/j.aca.2012.10.060

20. Determination of food authenticity by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / L. Asensio [et al.] // Food Control. 2008. Vol. 19, Iss. 1. P. 1–8. doi: 10.1016/j.foodcont.2007.02.010

21. О разработке метрологического обеспечения идентификации и количественного определения содержания неинфекционных пищевых аллергенов белкового животного или растительного происхождения в пищевых продуктах / О. Е. Первухина [и др.] // Эталоны. Стандартные образцы. 2023. Т. 19, № 3. С. 145–158. doi: 10.20915/2077-1177-2023-19-3-145-158

22. Первухина О. Е., Крашенинина М. П. Разработка стандартных образцов состава муки соевой и изолята соевого с аттестованными характеристиками массовой доли соевого ингибитора трипсина и массовой доли азота (белка) // За нами будущее : сборник тезисов докладов II Международной научно-практической конференции, Екатеринбург, 14–16 июня 2023 г. / Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии [и др.]. СПб: ООО «Издательско-полиграфическая компания «Коста», 2023. С. 80–86.

23. ГОСТ 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений = State system for ensuring the uniformity of measurements. Procedures of measurements. М.: Стандартинформ, 2011.

24. ГОСТ Р 58144–2018 Вода дистиллированная. Технические условия. М.: Стандартинформ, 2022.

25. ГОСТ Р 55878–2013 Спирт этиловый технический гидролизный ректификованный. Технические условия. М.: Стандартинформ, 2011.

26. РМГ 61–2010 Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки = State system for ensuring the uniformity of measurements. Accuracy, trueness and precision measures of the procedures for quantitative chemical analysis. Methods of evaluation. М.: Стандартинформ, 2013.

27. Об обеспечении единства измерений: Федер. закон Рос. Федерации от 26 июня 2008 г. № 102–ФЗ: принят Гос. Думой Федер. Собрания Рос. Федерации 11 июня 2008 г.: одобрен Советом Федерации Федер. Собр. Рос. Федерации 18 июня 2008 г. (в редакции от 11 июня 2021 г. № 170-ФЗ) // Росс. газета. 2008. 2 июля.

28. Об утверждении Порядка аттестации первичных референтных методик (методов) измерений, референтных методик (методов) измерений и методик (методов) измерений и их применения: приказ Министерства промышленности и торговли Российской Федерации от 15 декабря 2015 г. № 4091 // Официальный интернет-портал правовой информации. Дата опубликования: 26. 02. 2016. Номер опубликования: 0001201602260008.

29. ТР ТС 022/2011 Пищевая продукция в части ее маркировки: Технический регламент таможенного союза (с изменениями на 14 сентября 2018 года) // электронный фонд нормативно-технической и нормативно-правовой информации Консорциума «Кодекс» [сайт]. URL: http://www.tsouz.ru/db/techreglam/documents/trtspishevkamarkirovka.pdf