rmjournalЭталоны. Стандартные образцыMeasurement Standards. Reference Materials2687-0886D. I. Mendeleyev Institute for Metrology10.20915/2077-1177-2023-19-5-127-141rmjournal-449Research ArticleСовременные методы анализа веществ и материаловModern methods of analysis of substances and materialsМетодика измерений массовой доли соевого ингибитора трипсина: особенности разработки и аттестацииMethod for Measuring the Mass Fraction of Soybean Trypsin Inhibitor: Features of Development and Certificationhttps://orcid.org/0009-0004-7051-9833ПервухинаО. Е.PervukhinaO. E.

Олеся Евгеньевна Первухина, инженер

лаборатория метрологии влагометрии и стандартных образцов

620075

ул. Красноармейская, 4

Екатеринбург

Researcher ID https://www.researchid.co/rid69022

Olesya E. Pervukhina, Engineer

Laboratory for Metrological Support of Moisture Measurement and Reference Materials

620075

4 Krasnoarmeyskaya st.

Yekaterinburg

Researcher ID https://www.researchid.co/rid69022

pervuhinaoe@uniim.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3691-1124КрашенининаМ. П.KrashenininaM. P.

Мария Павловна Крашенинина, канд. техн. наук, ученый хранитель ГЭТ 173, ученый хранитель ГВЭТ 208–1, старший научный сотрудник

лаборатория метрологии влагометрии и стандартных образцов

620075

ул. Красноармейская, 4

Екатеринбург

Researcher ID: B-8302–2019

Maria P. Krasheninina, Cand. Sci. (Eng.), Assistant Scientific Custodian of GET 173, Scientific Custodian of GVET 208–1, Senior Researcher

Laboratory for Metrological Support of Moisture Measurement and Reference Materials

620075

4 Krasnoarmeyskaya st.

Yekaterinburg

krasheninina_m@uniim.ruПетуховП. А.PetukhovP. A.

Павел Александрович Петухов, директор по развитию

105264

ул. 9-я Парковая, 48,1

Москва

Pavel A. Petukhov, Development Director

105264

48,1 Parkovaia st.

Moscow

onco.xema@gmail.ruМайгуроваВ. Н.MaigurovaV. N.

Валентина Николаевна Майгурова, менеджер клиентского сервиса

105264

ул. 9-я Парковая, 48,1

Москва

Valentina N. Maigurova,  Customer Service Manager

105264

48,1 Parkovaia st.

Moscow

onco.xema@gmail.ruУральский научно-исследовательский институт метрологии – филиал ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д. И. Менделеева»РоссияUNIIM – Affiliated Branch of the D. I. Mendeleyev Institute for MetrologyRussian FederationООО «ХЕМА»РоссияLLC HEMARussian Federation202307012024195127141Copyright © Первухина О.Е., Крашенинина М.П., Петухов П.А., Майгурова В.Н., 20242024Первухина О.Е., Крашенинина М.П., Петухов П.А., Майгурова В.Н.Pervukhina O.E., Krasheninina M.P., Petukhov P.A., Maigurova V.N.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.rmjournal.ru/jour/article/view/449

   Современная индустриализация повышает требования к точности определения аллергенов, особенно в отношении оказывающих негативное воздействие, среди них – соевый ингибитор трипсина (СИТ). Корректное определение наличия СИТ в пищевых продуктах, содержащих соевые бобы, является ключевым для контроля безопасности и маркировки продукции. Сложилась общепринятая практика определять аллергены сои количественно с помощью аналитических методов анализа. Авторы данной статьи поставили цель разработать и аттестовать методику измерений массовой доли СИТ методом иммуноферментного анализа – методику, способную повысить специфичность метода и избежать ложноотрицательных результатов ее применения.

   Объектом исследования стал метод анализа пищевых аллергенов – иммуноферментный анализ, реализованный набором реагентов производства ООО «ХЕМА».

   В процессе разработки методики измерений оптимизированы основные методические факторы, влияющие на точность результатов измерений: масса пробы, время ее экстракции, время и скорость центрифугирования пробы, соотношение надосадочной жидкости и ИФА-буфера, температура инкубации, время взаимодействия комплекса антитело-аллерген с окрашивающим агентом, длина волны для измерения оптической плотности и максимальное время для измерения оптической плотности после введения стоп-реагента. Разработанная методика апробирована в ходе межлабораторного эксперимента с участием 5 лабораторий. Метрологические характеристики установлены в соответствии с РМГ 61–2010. Предлагаемый метод был аттестован в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-2009, № 102–ФЗ. Метод имеет широкий диапазон количественного определения массовой доли СИТ от 0,5 до 25,0 мкг/кг (ppb) с пределом обнаружения 0,1 мкг/кг (ppb) и относительной погрешностью 40 %. По результатам проведенного исследования в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений (ФИФ) зарегистрирована аттестованная методика идентификации и количественного определения содержания неинфекционных пищевых аллергенов белкового растительного происхождения в пробах всех видов пищевых продуктов и объектов, связанных с требованиями к пищевой продукции, смывов, отбираемых с рабочих поверхностей при проведении производственного контроля, с помощью наборов реагентов для иммуноферментного анализа производства ООО «ХЕМА» № ФР.1.31.2022.43884. Методика предназначена для применения в испытательных лабораториях, занимающихся контролем качества и безопасности выпускаемой продукции, может быть использована для подтверждения соответствия продукции обязательным требованиям, установленным в Техническом регламенте Таможенного союза ТР ТС 022/2012.

   Modern industrialization increases the requirements for the accuracy of identifying allergens, especially those that have a negative impact – soy trypsin inhibitor (STI). Correct determination of the presence of STI in food products containing soybeans is key for product safety control and labeling. The authors set a goal to develop and certify a method for measuring the mass fraction of STI using an enzyme-linked immunosorbent assay – a technique that may increase the specificity of the method and avoid false-negative results.

   The object of research was a method for analyzing food allergens – an enzyme-linked immunosorbent assay carried out with a set of reagents produced by XEMA LLC. In the process of developing the measurement method, the main methodological factors influencing the accuracy of the measurement results were optimized: sample weight, time of its extraction, time and speed of sample centrifugation, ratio of supernatant liquid to ELISA buffer, incubation temperature, interaction time of the allergen-antibody complex with the coloring agent, the wavelength for measuring absorbance, and the maximum time for measuring absorbance after introduction of the stop reagent.

   The developed method was tested during an interlaboratory experiment with the participation of 5 laboratories. Metrological characteristics were established in accordance with RMG 61–2010. The proposed method was certified in accordance with the requirements of GOST R8.563-2009, No. 102–FZ. The method has a wide range of quantitative determination of the mass fraction of STI from 0.5 to 25.0 μg/kg (ppb) with a detection limit of 0.1 μg/kg (ppb) and a relative error of 40 %. Based on the results of the research, the Federal Information Fund for Ensuring the Uniformity of Measurements (FIF) registered a certified method for identifying and quantifying the content of non-infectious food allergens of plant protein origin in samples of all types of food products and objects related to the requirements for food products, swabs taken from working surfaces during production control using reagent kits for an enzyme-linked immunosorbent assay produced by XEMA LLC No. FR.1.31.2022.43884. The method is intended for use in testing laboratories involved in monitoring the quality and safety of manufactured products; it can be used to confirm product compliance with the mandatory requirements established in the Technical Regulations of the Customs Union TR CU022/2012.

пищевая аллергияаллергеныметодика измеренийиммуноферментный анализсоевый ингибитор трипсинаfood allergyallergensmeasurement methodenzyme-linked immunosorbent assaysoybean trypsin inhibitorЭто исследование не получало финансовой поддержки в виде гранта от какой-либо организации государственного, коммерческого или некоммерческого сектораThis research did not receive financial support in the form of a grant from any governmental, for-profit, or non-profit organizationReferencesJiang X., Jackson L. S. Food allergens // Encyclopedia of Food Safety (Second edition). Academic Press, 2024. P. 295–308. doi: 10.1016/B978-0-12-822521-9.00233–1Jiang X., Jackson L. S. Food Allergens. Encyclopedia of Food Safety (Second Edition). 2024:295–308. doi: 10.1016/B978-0-12-822521-9.00233–1Намазова-Баранова Л. С. Аллергия у детей: от теории к практике. М.: Союз педиатров России. 2010–2011. 668 с.Namazova-Baranova L. S. Allergy in children: from theory to practice. Moscow: Soiuz pediatrov Rossii; 2010–2011. 668 p. (In Russ.).EAACI food allergy and anaphylaxis guidelines: diagnosis and management of food allergy / A. Muraro [et al.] // Allergy. 2014. Vol. 69, № 8. P. 1008–1025. doi: 10.1111/all.12429Muraro A., Werfel T., Hoffmann-Sommergruber K. et al. EAACI food allergy and anaphylaxis guidelines: diagnosis and management of food allergy. Allergy. 2014;69(8):1008–1025. doi: 10.1111/all.12429Пищевая аллергия / А. А. Баранов [и др.]. М.: Педиатръ, 2013. Сер. Болезни детского возраста от А до Я.Baranov A. A., Namazova-Baranova L. S., Borovik T. E. et al. Food allergy. Iss. Bolezni detskogo vozrasta ot A do Ia. Moscow: Pediatr; 2013. (In Russ.).Prescott S., Allen K. J. Food allergy: riding the second wave of allergy epidemic // Pediatric Allergy and Immunology. 2011. Vol. 22, № 1. P. 156–160. doi: 10.1111/j.1399–3038.2011.01145.xPrescott S., Allen K. J. Food allergy: riding the second wave of allergy epidemic. Pediatric Allergy and Immunology. 2011;22(1):156–160. doi: 10.1111/j.1399–3038.2011.01145.xCodex Alimentarius: International food standarts. Code of practice on food allergen management for food business operators CXC80–2020 Adopted in 2020.Codex Alimentarius: International food standarts. Code of practice on food allergen management for food business operators CXC80–2020 Adopted in 2020.Kerezsi A. D., Jacquet N., Blecker Ch. Advances on physical treatments for soy allergens reduction – A review // Trends in Food Science & Technology. 2022. Vol. 122. P. 24–39. doi: 10.1016/j.tifs.2022.02.007Kerezsi A. D., Jacquet N., Blecker Ch. Advances on physical treatments for soy allergens reduction – A review. Trends in Food Science & Technology. 2022;122:24–39. doi: 10.1016/j.tifs.2022.02.007.L’Hocine L., Boye Jo. I. Allergenicity of soybean: new developments in identification of allergenic proteins, cross-reactivities and hypoallergenization technologies // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2007. Vol. 47, № 2. P. 127–43. doi: 10.1080/10408390600626487L’Hocine L., Boye Jo. I. Allergenicity of soybean: new developments in identification of allergenic proteins, cross-reactivities and hypoallergenization technologies. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2007;47(2):127–43. doi: 10.1080/10408390600626487.Пищевая аллергия: Клинические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации. М.: Союз педиатров России, 2018. 50 с.Food allergy: clinical recommendations of the Ministry of Health of the Russian Federation. Moscow: Pediatr; 2018. 50 p. (In Russ.).Vagadia B. H., Vanga S. K., Raghavan V. Inactivation methods of soybean trypsin inhibitor – a review // Trends in Food Science & Technology. 2017. Vol. 64. P. 115–125. doi: 10.1016/j.tifs.2017.02.003Vagadia B. H., Vanga S. K., Raghavan V. Inactivation methods of soybean trypsin inhibitor – a review. Trends in Food Science & Technology. 2017;64:115–125. doi: 10.1016/j.tifs.2017.02.003Stability of the allergenic soybean Kunitz trypsin inhibitor / R. Roychaudhuri [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 2004. Vol. 1699, Iss. 1–2. P. 207–212. doi: 10.1016/j.bbapap.2004.02.014Roychaudhuri R., Sarath G., Zeece M., Markwell Jo. Stability of the allergenic soybean Kunitz trypsin inhibitor. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. Volume 2004;1699(1–2):207–212. doi: 10.1016/j.bbapap.2004.02.014.Comparison of physicochemical properties of recombinant buckwheat trypsin inhibitor (rBTI) and soybean trypsin inhibitor (SBTI) / Ch. Li [et al.] // Protein Expression and Purification. 2020. Vol. 171. P. 105614. doi: 10.1016/j.pep.2020.105614Li Ch., Li W., Yi Zh., Simpson B. K. Comparison of physicochemical properties of recombinant buckwheat trypsin inhibitor (rBTI) and soybean trypsin inhibitor (SBTI). Protein Expression and Purification, 2020;171:105614. doi: 10.1016/j.pep.2020.105614Recent advances and challenges in food-borne allergen detection / A. Sena-Torralba [et al.] // TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2020. Vol. 132. P. 116050. doi: 10.1016/j.trac.2020.116050Sena-Torralba A., Pallás-Tamarit Y., Morais S., Maquieira A. Recent advances and challenges in food-borne allergen detection. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2020;132: 116050. doi: 10.1016/j.trac.2020.116050Sensitive detection of soy (glycine max) by real-time polymerase chain reaction targeting the mitochondrial atpA Gene / T. Bauer [et al.] // AOAC International. 2011. Vol. 94, Iss. 6. P. 1863–1873. doi: 10.5740/jaoacint.10–257Bauer T., Kirschbaum K., Panter S., Kenk M., Bergemann J. Sensitive detection of soy (Glycine max) by real-time polymerase chain reaction targeting the mitochondrial atpA Gene. AOAC International. 2011;94(6):1863–1873. doi: 10.5740/jaoacint.10–257Development of a real-time PCR method for the simultaneous detection of soya and lupin mitochondrial DNA as markers for the presence of allergens in processed food / A. M. Gomez [et al.] // Food Chemistry. 2011. Vol. 127, Iss. 2. P. 834–841. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.01.019Gomez Galan A. M., Brohée M., Silva E. de A., van Hengel A. J., Chassaigne H. Development of a real-time PCR method for the simultaneous detection of soya and lupin mitochondrial DNA as markers for the presence of allergens in processed food. Food Chemistry. 2011;127(2):834–841. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.01.019Advanced DNA- and protein-based methods for the detection and investigation of food allergens / M. Prado [et al.] // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2016. Vol. 56, № 15. P. 2511–2542. doi: 10.1080/10408398.2013.873767Prado M., Ortea I., Vial S., Rivas J., Calo-Mata P., Barros-Velázquez J. Advanced DNA- and protein-based methods for the detection and investigation of food allergens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2016;56(15):2511–2542. doi: 10.1080/10408398.2013.873767Development and validation of a specific sandwich ELISA for determination of soybean allergens and its application in processed foods / L. Zhu [et al.] // Process Biochemistry. 2022. Vol. 117. P. 134–141. doi: 10.1016/j.procbio.2022.03.022Zhu L., Li S., Sun L. et al. Development and validation of a specific sandwich ELISA for determination of soybean allergens and its application in processed foods. Process Biochemistry. 2022;117:134–141. doi: 10.1016/j.procbio.2022.03.022.Determination of egg and milk allergen in food products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on signature peptides and isotope-labeled internal standard / S. Fan [et al.] // Food Science and Human Wellness. 2023. Vol. 12, Iss. 3. P. 728–736. doi: 10.1016/j.fshw.2022.09.006Fan S., Ma J., Liu Z. et al. Determination of egg and milk allergen in food products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on signature peptides and isotope-labeled internal standard. Food Science and Human Wellness. 2023;12(3):728–736. doi: 10.1016/j.fshw.2022.09.006Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels : A review / X. Pei [et al.] // Analytica Chimica Acta. 2013. Vol. 758, Iss. 3. P. 1–18. doi: 10.1016/j.aca.2012.10.060Pei X., Zhang B., Tang J. et al. Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels : A review. Analytica Chimica Acta. 2013;758(3):1–18. doi: 10.1016/j.aca.2012.10.060Determination of food authenticity by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / L. Asensio [et al.] // Food Control. 2008. Vol. 19, Iss. 1. P. 1–8. doi: 10.1016/j.foodcont.2007.02.010Asensio L., González I., García T., Martín R. Determination of food authenticity by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Food Control. 2008;19(1):1–8. doi: 10.1016/j.foodcont.2007.02.010О разработке метрологического обеспечения идентификации и количественного определения содержания неинфекционных пищевых аллергенов белкового животного или растительного происхождения в пищевых продуктах / О. Е. Первухина [и др.] // Эталоны. Стандартные образцы. 2023. Т. 19, № 3. С. 145–158. doi: 10.20915/2077-1177-2023-19-3-145-158Pervukhina O. Е. Sergeeva A. S., Krasheninina M. P. et al. On the development of metrological support for the identification and quantitative determination of the content of non-infectious food allergens of animal or plant protein origin in food products. Measurement Standards. Reference Materials. 2023;19(3):145–158. (In Russ.). doi: 10.20915/2077-1177-2023-19-3-145-158.Первухина О. Е., Крашенинина М. П. Разработка стандартных образцов состава муки соевой и изолята соевого с аттестованными характеристиками массовой доли соевого ингибитора трипсина и массовой доли азота (белка) // За нами будущее : сборник тезисов докладов II Международной научно-практической конференции, Екатеринбург, 14–16 июня 2023 г. / Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии [и др.]. СПб: ООО «Издательско-полиграфическая компания «Коста», 2023. С. 80–86.Pervukhina O. Е., Krasheninina M. P. On the development of standard samples of soybean flour and soybean isolate composition with certified characteristics of mass fraction of soybean trypsin inhibitor and mass fraction of nitrogen (protein). In: We are the future: Collection of works II international scientific conference, 14–16 June 2023, Yekaterinburg. Federal Agency on Technica/l Regulating and Metrology et al., Kosta Publishing and Printing Company LLC; 2023. P. 80–86. (In Russ.).ГОСТ 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений = State system for ensuring the uniformity of measurements. Procedures of measurements. М.: Стандартинформ, 2011.ГОСТ 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений = State system for ensuring the uniformity of measurements. Procedures of measurements. М.: Стандартинформ, 2011.ГОСТ Р 58144–2018 Вода дистиллированная. Технические условия. М.: Стандартинформ, 2022.ГОСТ Р 58144–2018 Вода дистиллированная. Технические условия. М.: Стандартинформ, 2022.ГОСТ Р 55878–2013 Спирт этиловый технический гидролизный ректификованный. Технические условия. М.: Стандартинформ, 2011.ГОСТ Р 55878–2013 Спирт этиловый технический гидролизный ректификованный. Технические условия. М.: Стандартинформ, 2011.РМГ 61–2010 Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки = State system for ensuring the uniformity of measurements. Accuracy, trueness and precision measures of the procedures for quantitative chemical analysis. Methods of evaluation. М.: Стандартинформ, 2013.РМГ 61–2010 Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки = State system for ensuring the uniformity of measurements. Accuracy, trueness and precision measures of the procedures for quantitative chemical analysis. Methods of evaluation. М.: Стандартинформ, 2013.Об обеспечении единства измерений: Федер. закон Рос. Федерации от 26 июня 2008 г. № 102–ФЗ: принят Гос. Думой Федер. Собрания Рос. Федерации 11 июня 2008 г.: одобрен Советом Федерации Федер. Собр. Рос. Федерации 18 июня 2008 г. (в редакции от 11 июня 2021 г. № 170-ФЗ) // Росс. газета. 2008. 2 июля.Об обеспечении единства измерений: Федер. закон Рос. Федерации от 26 июня 2008 г. № 102–ФЗ: принят Гос. Думой Федер. Собрания Рос. Федерации 11 июня 2008 г.: одобрен Советом Федерации Федер. Собр. Рос. Федерации 18 июня 2008 г. (в редакции от 11 июня 2021 г. № 170-ФЗ) // Росс. газета. 2008. 2 июля.Об утверждении Порядка аттестации первичных референтных методик (методов) измерений, референтных методик (методов) измерений и методик (методов) измерений и их применения: приказ Министерства промышленности и торговли Российской Федерации от 15 декабря 2015 г. № 4091 // Официальный интернет-портал правовой информации. Дата опубликования: 26. 02. 2016. Номер опубликования: 0001201602260008.Об утверждении Порядка аттестации первичных референтных методик (методов) измерений, референтных методик (методов) измерений и методик (методов) измерений и их применения: приказ Министерства промышленности и торговли Российской Федерации от 15 декабря 2015 г. № 4091 // Официальный интернет-портал правовой информации. Дата опубликования: 26. 02. 2016. Номер опубликования: 0001201602260008.ТР ТС 022/2011 Пищевая продукция в части ее маркировки: Технический регламент таможенного союза (с изменениями на 14 сентября 2018 года) // электронный фонд нормативно-технической и нормативно-правовой информации Консорциума «Кодекс» [сайт]. URL: http://www.tsouz.ru/db/techreglam/documents/trtspishevkamarkirovka.pdfТР ТС 022/2011 Пищевая продукция в части ее маркировки: Технический регламент таможенного союза (с изменениями на 14 сентября 2018 года) // электронный фонд нормативно-технической и нормативно-правовой информации Консорциума «Кодекс» [сайт]. URL: http://www.tsouz.ru/db/techreglam/documents/trtspishevkamarkirovka.pdf

The authors declare that there are no conflicts of interest present.