rmjournalЭталоны. Стандартные образцыMeasurement Standards. Reference Materials2687-0886D. I. Mendeleyev Institute for Metrology10.20915/2077-1177-2023-19-2-5-17rmjournal-384Research ArticleСтандартные образцыReference materialsМолекулярная диагностика онкологических заболеваний: перспективы разработки стандартного образца содержания гена HER2Molecular Diagnostics of Oncological Disease: Prospects for the Development of a Reference Material for the HER2 gene Contenthttps://orcid.org/0000-0003-4061-7411ВонскийМ. С.VonskyM. S.

Вонский Максим Сергеевич – канд. биол. наук, руководитель отдела государственных эталонов и стандартных образцов в области биоаналитических и медицинских измерений

190005, г. Санкт-Петербург, Московский пр., д. 19

Maxim S. Vonsky – Cand. Sci. (Biol.), Head of the department of state standards and reference materials in the f ield of bioanalytical and medical measurements

19 Moskovskiy ave., St. Petersburg, 190005

m.s.vonsky@vniim.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9496-4414РуновА. Л.RunovA. L.

Рунов Андрей Леонидович – и. о. руководителя сектора государственных эталонов в области биоаналитических измерений

190005, г. Санкт-Петербург, Московский пр., д. 19

Andrei L. Runov – Acting Head of the sector of state standards in the field of bioanalytical measurements

19 Moskovskiy ave., St. Petersburg, 190005

a.l.runov@vniim.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2854-3528ГорячаяТ. С.GorjachayaT. S.

Горячая Татьяна Станиславовна – ведущий инженер с возложением обязанностей руководителя группы по контролю и обеспечению качества Центра клеточных технологий ФГБУН «Институт цитологии РАН»

190005, г. Санкт-Петербург, Московский пр., д. 19

194064, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

Tatjana S. Gorjachaya – Leading Engineer with the duties of the Head of the group for quality control and quality assurance of the Center for Cell Technologies Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences

19 Moskovskiy ave., St. Petersburg, 190005

4 Tikhoretsky ave., St. Petersburg, 194064

goryachaya.tanya@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3863-4987КольцоваА. М.KoltsovaA. M.

Кольцова Анна Михайловна – канд. биол. наук, старший научный сотрудник с возложением обязанностей заведующего Центра коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных»

194064, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

Anna M. Koltsova – Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher with the duties of the Head of the Common Use Center «Vertebrate Cell Culture Collection»

4 Tikhoretsky ave., St. Petersburg, 194064

koltsova.am@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3084-463XКурчаковаЕ. В.KurchakovaE. V.

Курчакова Елена Владимировна – инженер сектора государственных эталонов в области биоаналитических измерений

190005, г. Санкт-Петербург, Московский пр., д. 19

Elena V. Kurchakova – Engineer of the sector of state standards in the field of bioanalytical measurements

19 Moskovskiy ave., St. Petersburg, 190005

e.v.kurchakova@vniim.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9354-8790НазаровВ. Д.NazarovV. D.

Назаров Владимир Дмитриевич – канд. мед. наук, младший научный сотрудник лаборатории диагностики аутоиммунных заболеваний

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6–8

Vladimir D. Nazarov – Cand. Sci. (Med.), Junior Researcher of the laboratory for diagnostics of autoimmune diseases of the Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine

6–8 Lev Tolstoy str., St. Petersburg, 197022

nazarov19932@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4998-3699ЛапинС. В.LapinS. V.

Лапин Сергей Владимирович – канд. мед. наук, заведующий лабораторией диагностики аутоиммунных заболеваний

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6–8

Sergey V. Lapin – Cand. Sci. (Med.), H ead o f t he l aboratory for diagnostics of autoimmune diseases o f the Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine

6–8 Lev Tolstoy str., St. Petersburg, 197022

svlapin@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3055-6507МазингА. В.MazingA. V.

Мазинг Александра Васильевна – канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6–8

Alexandra V. Mazing – Cand. Sci. (Med.), Leading Researcher of the laboratory of molecular diagnostics of the Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine

6–8 Lev Tolstoy str., St. Petersburg, 197022

alex_mazing@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2079-0439ЭмануэльВ. Л.EmanuelV. L.

Эмануэль Владимир Леонидович – д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6–8

Vladimir L. Emanuel – Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of the department of clinical laboratory diagnostics with the course of molecular medicine

6–8 Lev Tolstoy str., St. Petersburg, 197022

vladimirem1@gmail.comФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д. И. Менделеева»РоссияD. I. Mendeleyev Institute for MetrologyRussian FederationФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д. И. Менделеева»; ФГБУН «Институт цитологии» Российской академии наукРоссияD. I. Mendeleyev Institute for Metrology; Institute of Cytology of the Russian Academy of SciencesRussian FederationФГБУН «Институт цитологии» Российской академии наукРоссияInstitute of Cytology of the Russian Academy of SciencesRussian FederationФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Научно-методический центр Минздрава России по молекулярной медицинеРоссияPavlov First Saint Petersburg State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, Scientific and Methodological Center for the Russian Health Ministry on Molecular MedicineRussian Federation202310042023192517Copyright © Вонский М.С., Рунов А.Л., Горячая Т.С., Кольцова А.М., Курчакова Е.В., Назаров В.Д., Лапин С.В., Мазинг А.В., Эмануэль В.Л., 20232023Вонский М.С., Рунов А.Л., Горячая Т.С., Кольцова А.М., Курчакова Е.В., Назаров В.Д., Лапин С.В., Мазинг А.В., Эмануэль В.Л.Vonsky M.S., Runov A.L., Gorjachaya T.S., Koltsova A.M., Kurchakova E.V., Nazarov V.D., Lapin S.V., Mazing A.V., Emanuel V.L.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.rmjournal.ru/jour/article/view/384

Онкологические заболевания являются основной причиной смертности в мире. Развитие онкопатологий тесно связано с различными изменениями генетического материала, возникающими в злокачественно трансформированных клетках. Принятие медицинских решений требует четкой дифференциации нормальных и патологических показателей, являющихся в том числе результатами применения количественных методов в лабораторной медицине. Исследования ДНК, выделенной из биологического материала пациента, выявление и измерения содержания последовательностей нуклеотидов, выступающих в роли биомаркеров онкопатологий, позволяют решать задачи определения генетических предпосылок развития рака, его диагностики на ранней стадии, определения стратегии лечения, его мониторинга, подтверждения излечения пациента.

Целью данного исследования является выработка основных подходов к созданию стандартных образцов (СО) ДНК для метрологического обеспечения молекулярной диагностики онкопатологий на примере СО содержания последовательности гена HER2 в составе генома человека, значение величины «число копий последовательности ДНК» которого метрологически прослеживается к естественной единице SI «один».

В ходе исследования разработана методика выполнения измерений копийности (числа копий последовательности гена на геном) гена HER2, основанная на применении метода цифровой ПЦР (цПЦР). Показана сходимость результатов измерений для разработанной авторами методики и результатов, полученных с использованием коммерческого набора, использующего метод MLPA на образцах биологического материала человека.

Охарактеризованы пять постоянных клеточных линий из ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» по отношению числа копий последовательностей гена HER2 и генов CEP17 и RPPH1. Выявлена клеточная линия с повышенной копийностью гена HER2. Полученные результаты будут использованы при создании СО отношения числа копий последовательностей гена HER2 и генов RPPH1 и CEP17. Создание матричных СО ДНК на основе культур клеток человека, аттестованных с применением цПЦР, позволит передавать единицу величины числа копий последовательности ДНК калибраторам, входящим в состав медицинских изделий, обеспечивая тем самым требуемую достоверность и сопоставимость результатов измерений в лабораторной диагностике онкопатологий, а также возможность калибровки рутинных методик ДНК-диагностики и внутрилабораторного контроля качества.

Cancer is the leading cause of death in the world. The development of oncopathology is closely related to various changes in the genetic material that occur in malignantly transformed cells. Medical decision-making requires a clear differentiation between normal and pathological indicators, which are, among other things, the results of application of quantitative methods in laboratory medicine. Studies of DNA isolated from a patient’s biological material, identification and measurement of the content of nucleotide sequences acting as oncopathology biomarkers allow to solve the problems of determining the genetic prerequisites for cancer, its early diagnosis, determining the treatment strategy, monitoring, and confirming the patient’s cure.

The purpose of this research is to develop the main approaches to the design of DNA reference materials (RMs) for metrological support of molecular diagnostics of oncopathology through the example of the RM for the HER2 gene sequence content in the human genome, with the value of «the number of copies of the DNA sequence» which is metrologically traceable to the natural SI unit «one».

In the course of the research, a technique for measuring the HER2 gene amplification (the number of copies of the gene sequence per genome) was developed based on the use of the digital PCR method (dPCR). Comparability of measurement results for the method developed by the authors, and the results obtained using a commercial kit by the MLPA method on samples of human biological material is shown.

Five permanent cell lines obtained from the CUC «Vertebrate Cell Culture Collection» were characterized in relation to the copy number ratios of HER2 gene sequence and CEP17 and RPPH1 genes sequences. A cell line with the HER2 gene amplification was identified. The results obtained will be used to create the RM for the copy number ratio of the HER2 gene sequences and the RPPH1 and CEP17 gene sequences. Creation of matrix DNA RMs based on human cell cultures certified using dPCR will allow transferring the unit of copy numbers of the DNA sequence to calibrators included in medical devices, thereby ensuring the required reliability and comparability of measurement results in the laboratory diagnostics of oncopathology, as well as the possibility of calibrating routine methods of DNA diagnostics and intralaboratory quality control.

стандартные образцыонкодиагностикалабораторная медицинапоследовательность нуклеотидовчисло копий последовательностиreference materialscancer diagnosticslaboratory medicinenucleotide sequencesequence copy numberКлеточные культуры предоставлены ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных». Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Минобрнауки Российской Федерации, Соглашение № 075‑15‑2021‑683.Cell cultures were provided by the CUC «Vertebrate Cell Culture Collection». The research was supported by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Agreement № 075‑15‑2021‑683.ReferencesGlobal cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries / H. Sung [et al.] // CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2021. Vol. 71, № 3. P. 209–249. https://doi.org/10.3322/caac.21660Sung H., Ferlay J., Siegel R. L., Laversanne M., Soerjomataram I., Jemal A. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2021;71(3):209– 249. https://doi.org/10.3322/caac.21660Loeb K. R., Loeb L. A. Significance of multiple mutations in cancer // Carcinogenesis. 2000. Vol. 21, № 3. P. 379–385. https://doi.org/10.1093/carcin/21.3.379Loeb K. R., Loeb L. A. Significance of multiple mutations in cancer. Carcinogenesis. 2000;21(3):379–385. https://doi.org/10.1093/carcin/21.3.379Risks of breast, ovarian, and contralateral breast cancer for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers / K. B. Kuchenbaecker [et al.] // JAMA. 2017. Vol. 317, № 23. P. 2402–2416. https://doi:10.1001/jama.2017.7112Kuchenbaecker K. B., Hopper J. L., Barnes D. R., Phillips K.-A., Mooij T. M., Roos-Blom M.-J. Risks et al. of breast, ovarian, and contralateral breast cancer for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. JAMA. 2017;317(23):2402–2416. https://doi:10.1001/jama.2017.7112Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case series unselected for family history: A combined analysis of 22 studies / A. Antoniou [et al.] // American Journal of Human Genetics. 2003. Vol. 72, № 5. P. 1117–1130. https://doi:10.1086/375033Antoniou A., Pharoah P. D. P., Narod S., Risch H. A., Eyfjord J. E., Hopper J. L. et al. Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case series unselected for family history: A combined analysis of 22 studies. American Journal of Human Genetics. 2003;72(5):1117–1130. https://doi:10.1086/375033Chen S., Parmigiani G. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2 penetrance // Journal of Clinical Oncology. 2007. Vol. 25, № 11. P. 1329–1333. https://doi:10.1200/JCO.2006.09.1066Chen S., Parmigiani G. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2 penetrance. Journal of Clinical Oncology. 2007;25(11):1329–1333. https://doi:10.1200/JCO.2006.09.1066Cancer risks associated with BRCA1 and BRCA2 pathogenic variants / S. Li [et al.] // Journal of Clinical Oncology. 2022. Vol. 40, № 14. P. 1529–1541. https://doi.org/10.1200/JCO.21.02112Li Sh., Silvestri V., Leslie G., Rebbeck T. R., Neuhausen S. L., Hopper J. L. et al. Cancer risks associated with BRCA1 and BRCA2 pathogenic variants. Journal of Clinical Oncology. 2022;40(14):1529–1541. https://doi.org/10.1200/JCO.21.02112Berger M. F., Mardis E. R. The emerging clinical relevance of genomics in cancer medicine // Nature Reviews Clinical Oncology. 2018. Vol. 15, № 6. P. 353–365. https://doi.org/10.1038/s41571-018-0002-6Berger M. F., Mardis E. R. The emerging clinical relevance of genomics in cancer medicine. Nature Reviews Clinical Oncology. 2018;15(6):353–365. https://doi.org/10.1038/s41571-018-0002-6Tumor immune microenvironment and nivolumab efficacy in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer based on T790M status after disease progression during EGFR-TKI treatment / K. Haratani [et al.] // Annals of Oncology. 2017. Vol. 28, № 7. P. 1532–1539. https://doi.org/10.1093/annonc/mdx183Haratani K., Hayashi H., Tanaka T., Kaneda H., Togashi Y., Sakai K. et al. Tumor immune microenvironment and nivolumab efficacy in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer based on T790M status after disease progression during EGFR-TKI treatment. Annals of Oncology. 2017;28(7):1532–1539. https://doi.org/10.1093/annonc/mdx183Fluorouracil, leucovorin, and irinotecan plus cetuximab treatment and RAS mutations in colorectal cancer / E. V. Cutsem [et al.] // Journal of Clinical Oncology. 2015. Vol. 33, № 7. P. 692–700. https://doi.org/10.1200/JCO.2014.59.4812Cutsem E. V., Lenz H.-J., Köhne C.-H., Heinemann V., Tejpar S., Melezínek I. et al. Fluorouracil, leucovorin, and irinotecan plus cetuximab treatment and RAS mutations in colorectal cancer. Journal of Clinical Oncology. 2015;33(7):692–700. https://doi.org/10.1200/JCO.2014.59.4812Development of NIST standard reference material 2373: Genomic DNA standards for HER2 measurements / Hua-Jun He [et al.] // Biomolecular Detection and Quantification. 2016. Vol. 8. P. 1–8. https://doi.org/10.1016/j.bdq.2016.02.001He H.-J., Almeida J. L., Lund S., Steffen C. R. Development of NIST standard reference material 2373: Genomic DNA standards for HER2 measurements. Biomolecular Detection and Quantification. 2016;8:1–8. https://doi.org/10.1016/j.bdq.2016.02.001Development and interlaboratory evaluation of a NIST reference material RM 8366 for EGFR and MET gene copy number measurements / H. J. He [et al.] // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2019. Vol. 57, № 8. P. 1142–1152. https://doi.org/10.1515/cclm-2018–1306He H.-J., Das B., Cleveland M. H., Chen L., Camalier C. E., Liu L.-Ch. et al. Development and interlaboratory evaluation of a NIST reference material RM 8366 for EGFR and MET gene copy number measurements. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2019;57(8):1142–1152. https://doi.org/10.1515/cclm-2018–1306Metrological framework to support accurate, reliable, and reproducible nucleic acid measurements / M. Milavec [et al.] // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2022. Vol. 414, № 2. P. 791–806. https://doi.org/10.1007/s00216–021–03712-xMilavec M., Cleveland M. H., Bae Y.-K., Wielgosz R. I., Vonsky M., Huggett J. F. et al. Metrological framework to support accurate, reliable, and reproducible nucleic acid measurements. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2022;414(2):791–806. https://doi.org/10.1007/s00216–021–03712-xAlkabban F. M., Ferguson T. Breast cancer. Treasure Island: StatPearls Publishing, 2022. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482286 (дата обращения: 08.11.2022).Alkabban F. M., Ferguson T. Breast cancer. Treasure Island: StatPearls Publishing; 2022. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482286 [Accessed 08 November 2022].Activating HER2 mutations in HER2 gene amplification negative breast cancer / R. Bose [et al.] // Cancer Discov. 2013. Vol. 3, № 2. P. 224–237. https://doi.org/10.1158/2159–8290.CD-12–0349Bose R., Kavuri Sh. M., Searleman A. C., Shen W., Shen D., Koboldt D. C. et al. Activating HER2 mutations in HER2 gene amplification negative breast cancer. Cancer Discov. 2013;3(2):224–237. https://doi.org/10.1158/2159–8290.CD-12–0349Iqbal N., Iqbal N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in cancers: overexpression and therapeutic implications // Molecular Biology International. 2014. № 852748. https://doi:10.1155/2014/852748Iqbal N., Iqbal N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in cancers: overexpression and therapeutic implications. Molecular Biology International. 2014;852748. https://doi:10.1155/2014/852748Moasser M. M. The oncogene HER2: its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis // Oncogene. 2007. Vol. 26, № 45. P. 6469–6487. https://doi:10.1038/sj.onc.1210477Moasser M. M. The oncogene HER2: its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis. Oncogene. 2007;26(45):6469–6487. https://doi:10.1038/sj.onc.1210477Centromere 17 copy number gain reflects chromosomal instability in breast cancer / K. Lee [et al.] // Scientific Reports. 2019. Vol. 9, № 1. P. 17968. https://doi.org/10.1038/s41598–019–54471-wLee K., Kim H. J., Jang M. H., Lee S., Ahn S., Park Y. S. Centromere 17 copy number gain reflects chromosomal instability in breast cancer. Scientific Reports. 2019;9(1):17968. https://doi.org/10.1038/s41598–019–54471-wScherer W. F., Syverton J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix // Journal of Experimental Medicine. 1953. Vol. 97, № 5. P. 695–710. https://doi:10.1084/jem.97.5.695Scherer W. F., Syverton J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 1953;97(5):695–710. https://doi:10.1084/jem.97.5.695Droplet digital polymerase chain reaction detection of HER2 amplification in formalin fixed paraffin embedded breast and gastric carcinoma samples / Y. Zhu [et al.] // Experimental and Molecular Pathology. 2015. Vol. 100, № 2. P. 287–293. https://doi:10.1016/j.yexmp.2015.11.027Zhu Y., Lu D., Lira M. E., Xu Q., Du Y., Xiong J. et al. Droplet digital polymerase chain reaction detection of HER2 amplification in formalin fixed paraffin embedded breast and gastric carcinoma samples. Experimental and Molecular Pathology. 2015;100(2):287– 293. https://doi:10.1016/j.yexmp.2015.11.027Certification of standard reference material 2372a; Human DNA quantitation standard / E. L. Romsos [et al.] // NIST Special Publication. 2018. P. 260–189. https://doi:10.6028/NIST.SP.260–189Romsos E. L., Kline M. C., Duewer D. L., Toman B., Farkas N. Certification of standard reference material 2372a; Human DNA quantitation standard. NIST Special Publication. 2018:260–189. https://doi:10.6028/NIST.SP.260–189Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases / L. Stuppia [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. 2012. Vol. 13, № 3. P. 3245–3276. https://doi:10.3390/ijms13033245Stuppia L., Antonucci I., Palka G., Gatta V. Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases. International Journal of Molecular Sciences. 2012;13(3):3245–3276. https://doi:10.3390/ijms13033245Cousineau I., Belmaaza A. EMSY overexpression disrupts the BRCA2/ RAD51 pathway in the DNA-damage response: Implications for chromosomal instability/recombination syndromes as checkpoint diseases // Molecular Genetics and Genomics. 2011. Vol. 285, № 4. P. 325–340. https://doi:10.1007/s00438-011-0612-5Cousineau I., Belmaaza A. EMSY overexpression disrupts the BRCA2/ RAD51 pathway in the DNA-damage response: Implications for chromosomal instability/recombination syndromes as checkpoint diseases. Molecular Genetics and Genomics. 2011;285(4):325– 340. https://doi:10.1007/s00438-011-0612-5

The authors declare that there are no conflicts of interest present.